مرتبط با :
بیوشیمی
تجهیزات پزشکی
کروماتوگرافی تکنیکی
است که برای جدا سازی پروتئین ها در آزمایشگاه از ان بهره می بریم و به دو
نوع اصلی سطحی و ستونی تقسیم بندی می شود . در چند پست در مورد این تکنیک
بحث خواهیم کرد . تمام مطالب هم حاصل ترجمه از کتاب تیتز است . امیدواریم
که مفید باشد .
قبل از تعیین ویژگی ها و فعالیت های شیمایی
یک پروتئین باید ابتدا ان را خالص سازی کنیم . همان طور که اطلاع دارید
سلول از هزاران نوع پروتئین تشکیل شده است ولی چگونه این پروتئین ها را می
توانیم به صورت خالص تهیه کنیم ؟؟!! جداسازی پروتئین ها به ویژگی های مخصوص
هر پروتئین مانند اندازه ، بار الکتریکی و نحوه اتصال انها وابسته است .
منبع یک پروتئین معمولا کشت های میکروبی و یا بافت است . اولین مرحله در
خالص سازی پروتئین ها شکست سلول و آزاد کردن آنها در یک محلول به نام crude
extract (عصاره خام) می باشد . سانتریفیوژ افتراقی هم در صورت لزوم برای
جداسازی محلول های فراسلولی و یا جداسازی ساختار های خاص سلولی استفاده می
شود . زمانی که عصاره پروتئین از سلول استخراج
شد از روش های مختلفی می توان برای جداسازی و خالص سازی پروتئین(های)
تشکیل دهنده محلول استفاده کرد. معمولا از عصاره ، در زمینه درمانی
استفاده می شود که پروتئین ها را بر اساس اندازه و یا بار به قسمت های
مختلفی جداسازی می کنیم که به این روش "جزء به جزء کردن" یا fractionation
می گویند . مراحل اولیه خالص سازی پروتئین جدا از حلالیت پروتئین است و به
دما ، غلظت نمک ، PH و سایر فاکتور ها وابسته است . میزان انحلال پذیری
پروتئین در غلظت بالای نمک کمتر است که به این خاصیت پروتئین ها " salting
out " می گویند (معادل مناسبشو نتوسنتم پیدا کنم!) افزودن مقدار معینی از
نمک رسوب برخی از پروتئین ها را انتخاب می کند در حالی که رسوب برخی از
آنها باقی خواهد ماند . آمونیوم سولفات به علت قابلیت حل بالا در آب ،
ترکیبی است که برای این منظور مورد استفاده قرار می گیرد . قوی ترین روش
برای جداسازی جزء به جزء پروتئین ها کروماتوگرافی ستونی است که می تواند
پروتئین ها را بر اساس بار الکتریکی ، اندازه ، قدرت پیوند و ... جداسازی
کند . ماده جامد متخلخل با ویژگی های شیمیایی خاص (فاز ساکن) در ستونی
تعیبه می شود و محلول بافری (فاز متحرک) از میان آن تراوش می شود . محلول
حاوی پروتئین در بالای ستون به صورت لایه ای اندوده می شود و سپس به داخل
ماتریکس فاز ساکن تراوش می کند و با گسترش محلول باندهایی را در داخل فاز
ساکن ایجاد می کند . برخی از پروتئین ها بر اساس ویژگی های آنها به سرعت و
یا به کندی در ستون سیر می کنند. به طور مثال در کروماتوگرافی تعویض
کاتیونی ، فاز جامد دارای بار الکتریکی منفی است . در فاز متحرک ، پروتئین
ها با بار الکتریکی خالص مثبت با سرعت کمتری نسبت به پروتئین های دارای بار
الکتریکی خالص منفی حرکت می کنند به این علت که میزان مهاجرت به برهمکنش
فاز ساکن و پروتئین وابسته است .
دو پروتئین میتواند به دو باند مجزا جدا شود . وسعت باند پروتئین در فاز
متحرک (محلول پروتئینی) به دو عامل نوع خصوصیت جداسازی پروتئین و نحوه
تقسیم انتشار وابسته است . هر چه قدر طول ستون کروماتوگرافی بزرگتر شود دقت
جداسازی دو پروتئین با بار الکتریکی خالص متفاوت بیشتر خواهد شد . اگرچه
میزان سیر محلول پروتئینی در ستون با افزایش طول ستون کاهش خواهد یافت و
میزان زمانی که محلول در ستون خواهد بود بیشتر می شود .
عناصر
استاندارد سازنده یک کروماتوگراف ستونی شامل ماده جامد متخلل محفوظ در یک
ستون شیشه ای یا پلاستکی است . ماده جامد (ماتریکس) فاز ساکن را ایجاد می
کند که از میان ان محلول مهاجرت می کند که به ان فاز متحرک می گویند .
محلول تراوش شده به ستون از انتهای آن و از طریق خروجی تعبیه شده در پایین
ستون خارج می شود و از بالای ستون همین مقدار محلول توسط مخزن تعبیه شده
در بالای ستون به داخل ستون ترواش می شود . محلول پروتئینی که برای جداسازی
تهیه شده را به صورت لایه ای در بالای ستون قرار می دهیم و اجازه می دهیم
تا در تخلل های فاز ساکن نفوذ کند . فاز متحرک از تانک بر روی لایه نمونه
پروتئین می ریزد و با ان باند می شود . با مهاجرت پروتئین در ماتریکس کم کم
عده ای پروتئین ها به دلیل برهمکنش با فاز ساکن ، عقب می افتند و به لایه
هایی جدا می شوند . همه محلول پروتئین با گذشن زمان بر روی ستون پهن می شود
. پروتئین های خاص (در شکل A,B,C) به تدریج از یکدیگر جدا می شوند و
باندهای خاصی را تشکیل می دهند . رفته رفته با گسترش بیشتر محلول در ستون
دقت لایه های بیشتر می شود . در شکل پروتئین A نسبت به B,C بهتر جدا شده
است ولی انتشار یکسان B,C باعث کاهش دقت جداسازی آنها شده است .
اساس کار
کروموتوگرافی یک روش فیزیکی است که ترکیبات
یک محلول ساده را براساس توزیع متفاوت بین فاز ثابت و متحرک جدا می کند .
براساس این روش ، فاز متحرک ، نمونه را در یک سطح ، لایه و یا یک ستون
حاوی فاز ثابت ، با خود حمل می کند . با عبور و سیر فاز متحرک در مجاورت
فاز ثابت ، چند حالت زیر برای ترکیبات محلول اتفاق خواهد افتاد :
-
بر روی فاز ثابت مستقر می شود (بدون مهاجرت) .
-
بر روی فاز متحرک مستقر می شود (مهاجرت همراه با فاز متحرک).
-
بین دو فاز پخش می شود (مهاجرت متفاوت).
ذراتی که دارای میل زیادی نسبت به فاز ثابت
هستند در فاز ثابت مستقر می شوند و نسبت به سایر ذرات که دارای میل کمتری
هستند با سرعت کمی مهاجرت می کنند . ذرات دارای میل کمتر در روی فاز متحرک
مستقر می شوند و با سرعت بیشتر مهاجرت می کنند . بدین صورت ذرات جدا شده از
محلول که دارای میل کمتری نسبت به محلول هستند دارای میل زیادی نسبت به
فاز ثابت هستند . ذرات با پیوند های قوی به فاز ساکن متصل می شوند سپس با
تغییر خصوصیات فیزیکی و یا ویژگی های طبیعی شیمیایی فاز متحرک ، ذرات از
محل خود در فاز ثابت جابه جا می شوند.
کروماتوگرافی به دو گروه اصلی ستونی و سطحی
تقسیم بندی می شود . در کروماتوگرافی سطحی ، فاز ساکن بر روی یک صفحه کاغذ
اندوده می شود (کروماتوگرافی کاغذی) و یا اینکه به یک سطح جامد متصل می
شود (thin-layer chromatography [TLCI) . در
کروماتوگرافی کاغذی ، فاز ساکن (ثابت) یک لایه از آب و یا حلال قطبی است
که بر روی فیبر کاغذی اندوده شده است . در TLCI ، لایه نازکی از یک ماده
خاص مانند ژل سیلیکا بر روی یک صفحه شیشه ای یا لایه آلومینیومی و یا
پلاستیکی به طور یکنواخت پخش شده است . زمانی که ضخامت لایه ها نازک به
کمترین حالت ممکن برسد (4.5 میکرومتر) در این صورت به این روش کروماتوگرافی
HPTLC یا کروملتوگرافی لایه نازک فشار بالا گفته می شود .
در کروماتوگرافی ستونی ، فار ثابت می تواند
سلیکای خالص و یا پلیمر و یا اندوده شده در داخل آن و یا به صورت پیوند
شیمیایی متصل به آن باشد . ممکن است فاز ساکن به صورت "بسته ای" در داخل
تیوبی و یا اندوده شده در سطح داخلی فضای تیوب باشد . کروماتوگرافی ستونی
اگر دارای فاز متحرک گازی و یا مایع باشد، کروماتوگرافی گازی و یا
کروماتوگرافی مایع نامگذاری می شود . زمانی که در کروماتوگرافی مایع ،
ضخامت ذرات فاز ساکن بسیار کمتر باشد به آن HPLC می گویند . زمانی که
کروماتوگراف مایع و یا گازی به یک دستگاه طیف سنج متصل می شود ، دو تکنیک
با هم ترکیب می شوند و در فاز گازی GC-MS و در فاز مایع (LC-MS ) نام گذاری
می کنیم .
در کروماتوگراف تحلیلی GC و LC فاز متحرک یا
شوینده از ستون خارج می شود و از جلوی حس گری عبور میکند که باعث تولید و
رسم سیگنال های الکترونیکی براساس مسافت ، زمان و حجم میشود . رسم به دست
امده بدین صورت کروماتوگرام (chromatogram )نامیده می شود . زمان بازداری و
یا حجم محلول زمانی است که محلول از انژکتور خارج شده و به ستون ترزیق می
شود و از میان ستون و حسگر عبور می کند . اطلاعاتی که توسط کروماتوگرام به
دست میاید برای جداسازی و شناسایی ترکیبات محلول استفاده خواهد شد . از
آنجا که ذرات شستشو شده به صورت قله های سری (پیک در نمودار) گرافیکی دیده
می شوند . تکرار آنها تحت عنوان پیک کروماتوگرافیک خواهد بود . این پیک ها
با ارتفاع ، عرض و مساحت تعریف می شوند . در کروموتوگرافی سطحی و یا کاغذی ،
مناطق جداشده بر اساس رنگ های طبیعی آنها و یا با استفاده از اصلاح کننده
های شیمیایی به صورت نکته و یا باند های رنگی شناسایی می شوند .
مكانیزم جداسازی در كروماتوگراف
جداسازی
پروتئین در كروماتوگراف به دو كلاس شیمیایی و فیزیكی انجام می شود شامل :
تعویض یونی ، تفكیك كردن ، جذب سطحی ، انتخاب بر اساس اندازه و مكانیسم
پیوستگی می باشد . در مراحل اولیه پیدایش كروماتوگرافی علوم آزمایشگاهی ها
از دو روش تغییر یونی و همچنین مكانیسم تفكیكی یا پارتیشنی استفاده می كردند .
كروماتوگرافی تعویض یونی
كروماتوگرافی
تعویض یونی بر اساس تغییر یونها استوار است . در این روش بار سطح ثابت
(فاز ثابت) با بار مخالف خود در فاز متحرك ، تعویض می شود . بر اساس شرایط ،
مواد محلول كاتیون (بار مثبت) و یا انیون (بار منفی) هستند . آنها بر اساس
باریونی متفاوت خود و یا بر حسب مقدار بار یونی جدا می شوند . سطح ظریفی
از رزین و یا سلیكا میتواند فاز ساكن را در این نوع كروماتوگراف تشكیل دهد
كاتیون و یا انیون ها در این حالت بر روی فاز ساكن اندوده می شود و یا با
پیوند شیمیایی به آن (فاز ساكن) متصل می شود . برای حفظ بار الكتروشیمیایی
با تعویض یون ها ، counterion در نزدیكی فاز ساكن تعبیه می شود . یون های
محلول در فاز متحرك با counterion تعویض بار می شوند سپس یون های محلول با
تغییر ph ، قدرت یونی و یا هر دو فاز متحرك شسته و انتخاب می شوند .
تعویض كاتیونی ، حاوی
دسته از بار های منفی است كه برای جداسازی و یا "تعویض" ذرات كاتیونی
استفاده می شود . (یعنی ذراتی محلولی كه دارای بار مثبت هستند) . برای
نمونه : اسید های قوی مانند یون های سولفونات و اسید های ضعیف مانند یونهای
كربوكسیلات ، كربوكسی متیل ، فسفات ، سولفومتیل ، سولفواتیل و یا
سولفوپروپیل .
تعویض انیونی برای
جداسازی محلول های آنیونی مورد استفاده قرار می گیرد . انها دارای آمین های
تترامری هستند كه دارای بار مثبت هستند . برای نمونه : تری تیلامینواتیل و
یا گروه های ضعیف مانند آمینواتیل ، دی اتیل آمینواتیل ، گوانیدواتیل ،
اپی كلرودین-تریتانول آمین .
كروماتوگرافی تعویض
یونی دارای استفاده های گوناگونی در زمینه تشخیص بیماری است . جداسازی
امینواسیدها ، جداسازی پپتیدها ، جداسازی پروتئین ها ، جداسازی نوكلئوتیدها
و الیگونوكلئوتیدها و نوكلئیك اسید در آزمایشگاه تشخیص طبی بر اساس این
روش انجام می گیرد . جداسازی یون های غیرآلی از مخلوط های آبكی یكی دیگر از
استفاده های مهم كروماتوگرافی تعویض یونی است . برای مثال ، آب دیونیزه ، با استفاده از ستون های رزینی كاتیونی و آنیونی به دست می آید .
كروماتوگرافی پارتیشنی (تفكیكی)
توزیع
متفاوت ذره حل شونده در دو مایع غیر قابل مخلوط با هم اساس كروماتوگرافی
تفكیكی است . مایع مخلوط ناشدنی اولی نقش فاز ساكن را دارد . برای تهیه این
فاز ، لایه نازكی از مایع با پیوند شیمیایی و یا با جذب سطحی بر روی ذره
مورد نظر و یا داخل دیواره ستون موئینه ای اندوده می شود . جداسازی بر حسب
تفاوت در قابلیت حل مولكول های محلول بین فاز ساكن و فاز متحرك انجام می
گیرد . كروماتوگرافی تفكیكی همچنین به دو دسته gas-liquid chromatograohy و
liquid – liquid chromatography تقسیم بندی می شود . LLC هم خودش به دو
نوع فاز نرمال و یا فاز معكوس تقسیم بندی می شود . در LLC فاز نرمال ، مایع
قطبی (از نظر بار) به عنوان فار ساكن استفاده می شود و یك حلال غیرقطبی به
عنوان فاز متحرك خواهد بود . در كروماتوگرافی LLCفاز معكوس ، فاز ساكن غیر
قطبی است در حالی كه فاز متحرك قطبی است . توقف – یونی و كروماتوگرافی
جفت – یونی دو فرم از كروماتوگرافی فاز معكوس LLC هستند كه برای جداسازی
ذرات محلول مورد استفاده قرار می گیرد . در كروماتوگرافی توقف – یونی بخش
یونی باز و یا اسید ضعیف یا خنثی می شود و یا با تغییر میزان PH فاز
متحرك،ساپرس (متوقف ) می شود . با خنثی سازی گروه یونی ، محلول دارای قطبیت
كمی خواهد بود و در نتیجه قابلیت متصل شده به فاز ساكن غیر قطبی در ان
بیشتر می شود . ذرات ساپرس شده هم ویگی های همانند ذرات خنثی دارند و با
استفاده از كروماتوگرافی فاز معكوس جدا می شوند . از كروماتوگرافی جفت –
یونی هم برای جداسازی داروهای درمانی و متابولیسم آنها استفاده می كنیم .
كروماتوگرافی جذب سطحی
اساس
این نوع كروماتوگرافی هم بر اساس تفاوت در جذب سطحی و یا عدم جذب سطحی بر
روی ذره ای جامد است . نیرویهای الكترواستاتیك و همچنین پیوند یونی برهمكنش
های فیزیكی هستند كه این نوع كروماتوگرافی را كنترل می كنند . در GC از
این متد برای جداسازی تركیبات دارای وزن مولكولی كم (مانند : متیل ، اتیل ،
الكلهای ایزوپروپیل) و همچنین تركیباتی كه دارای فاز گازی در دمای اتاق
هستند استفاده می كنیم .
كروماتوگرافی انتخاب بر اساس اندازه
Size-exclusion
chromatography همچنین به نام های فیلتراسیون ژل ، تراوش ژل ، ممانعت
مولكولی و كروماتوگرافی مولكولی مشهور است . اساس این نوع كروماتوگرافی بر
جداسازی ذرات بر اساس اندازه های مولكولی انها استوار است . شكل مولكولی و
هیدارته شدن انها فاكتورهای تاثیر گذار در این نوع كروماتوگرافی است .
مواد گوناگونی به عنوان فاز ثابت در این روش مورد استفاده قرار می گیرد .
مثلا : دكستران كراس لینك ، پلی آكریل آمید ، آگاروز ، پلیسترین و ... . با
كنار هم قرار گرفتن این مواد خلل و فرج های بسیار كوچك موقتی ایجاد می شود
كه می تواند مولكول های كوچك را موقتا به دام بیندازد . مولكول ها با
اندازه بزرگ در فاز متحرك باقی می مانند و به سرعت از ستون شستشو داده می
شوند . از این نوع كروماتوگرافی برای مقاصد تحقیقاتی و تجزیه ای استفاده می
شود .
كروماتوگرافی پیوسته
در این نوع از
كروماتوگرافی ، از برهم كنش های ویژه و اختصاصی بیولوژی برای جداسازی ذرات
استفاده می كنیم .پیوند آنزیم – سوبتسرا ، هورمون – گیرنده و یا آنتی ژن –
آنتی بادی در این نوع از كروماتوگرافی استفاده می شود . اهمیت این تكنیك
در قدرت بالای انتخاب آن است . در آزمایشگاه از این روش برای جداسازی هموگلوبین های گلیكوزیله (ستون فنیل برونات - phenyl boronate
columns ) ولیپوپروتئین های LDL و VLDL (ستون هپارین) استفاده می شود .
همچنین از این روش برای تهیه پروتئین ها و آنتی بادی ها در مقادیر كمی زیاد
برای مقاصد تحقیقاتی بهره می بریم .
http://lab-sciences.blogfa.com
برچسب ها :
کروماتوگرافی 
